Через несколько лет император Юстиниан овдовел и решил разыскать Анастасию, чтобы жениться на ней. Узнав об этом, блаженная Анастасия немедленно направилась в далекий скит к авве Даниилу (память 18 марта) за помощью. Чтобы спасти Анастасию, старец облек ее в мужскую монашескую одежду и назвал Анастасием-евнухом. Поселив ее в одной из самых отдаленных пещер, старец дал ей молитвенное правило и повелел никогда не выходить из пещеры и никого у себя не принимать. Только один инок знал это место: он имел послушание раз в неделю приносить к пещере небольшой хлеб и кувшин воды, оставляя их у входа. В таком строгом затворе преподобная Анастасия прожила двадцать восемь лет. Все считали, что в пещере подвизается евнух Анастасий.

Господь открыл блаженной день ее кончины. Узнав о близкой смерти, она написала об этом авве Даниилу несколько слов на черепке и положила его у входа в пещеру. Старец вскоре пришел и принес все необходимое для ее погребения. Он нашел святую подвижницу уже при смерти, исповедал и причастил Святых ТаинПричащение. По просьбе аввы блаженная Анастасия благословила его и сопровождавшего его инока. Со словами: "Господи, в руки Твои предаю дух мой", - святая тихо скончалась (+ ок. 567 - 568).

Когда была готова могила, старец дал ученику свою рясу и велел одеть усопшего брата. Одевая рясу, инок понял, что перед ним женщина, однако не посмел ничего сказать. Когда же, похоронив преподобную, они возвращались в свою обитель, ученик спросил авву, знал ли он, что мнимый брат - женщина, и старец поведал молодому монаху историю святой Анастасии. Позднее рассказ старца был записан и получил широкую известность.

Мощи преподобной Анастасии в 1200 году были перенесены в Константинополь и положены недалеко от храма Святой Софии.